本文研究工作的目的在于寻找可提高自絮凝酵母VHG乙醇发酵水平的方法,并探索与此相关的菌体生理生化的变化。首先考察了不同起始葡萄糖浓度对自絮凝酵母VHG乙醇发酵的影响。研究发现,随着葡萄糖起始浓度的提高,残糖浓度增加,发酵时间延长。当用葡萄糖起始浓度为300 g/L进行发酵时,所得的终点乙醇浓度最高,为13.1% (v/v)。提示葡萄糖浓度为300 g/L可能是当前发酵条件下自絮凝酵母对葡萄糖耐受性的浓度界限点。因此,选择葡萄糖起始浓度为300 g/L进行后续的VHG乙醇发酵研究。接着考察了作为氮源的酵母浸出膏或蛋白胨浓度的改变,外源添加不同浓度的金属离子Mg2+或Ca2+对自絮凝酵母VHG乙醇发酵的影响。当培养基中酵母浸出膏和蛋白胨的含量分别为12.0 g/L和6.0 g/L时,终点乙醇浓度分别达到14.7% (v/v)和14.4% (v/v),比对照组(13.1%, v/v)分别提高了12%和10%。而当Mg2+和Ca2+的添加浓度分别为6.0 mmol/L和1.0 mmol/L时,终点乙醇浓度可分别达到14.3% (v/v)和14.4% (v/v)。比较金属离子和氮源对VHG乙醇发酵的促进作用可以发现,外源添加6.0 mmol/L Mg2+或1.0 mmol/LCa2+,与提高蛋白胨浓度(从3.0到6.0 g/L)或酵母浸出膏(从5.0到12.0 g/L)所达到的终点乙醇浓度相近,这表明Mg2+或Ca2+可以部分取代酵母浸出膏或蛋白胨来促进VHG乙醇发酵,这是一个新的实验现象,这将会明显降低乙醇的生产成本。进一步考察了培养基中含12.0 g/L酵母浸出膏或6.0 g/L蛋白胨、外源添加6.0 mmol/L Mg2+或1.0 mmol/L Ca2+条件下菌体生理生化的变化,以探索这些因素促进VHG乙醇发酵的可能机理。发酵培养基中含12.0 g/L酵母浸出膏或6.0 g/L蛋白胨可以增强自絮凝酵母抵抗高浓度葡萄糖胁迫的能力进而促进发酵,且这种促进作用与菌体质膜ATP酶的激活和胞内海藻糖的积累密切相关。而Mg2+对发酵的促进作用主要是激活ATP酶使菌体适应高浓度葡萄糖的胁迫,Ca2+则是通过迅速增加胞内海藻糖含量以抵抗外界不利条件的影响。这是首次关于质膜ATP酶和胞内海藻糖对酵母细胞抵抗高浓度葡萄糖胁迫起积极作用进而促进VHG乙醇发酵的报道。最后采用均匀设计法优化了(基于300 g/L起始浓度葡萄糖的)培养基组成,得出培养基最佳优化组合为Mg2+ 6.3 mmol/L、Ca2+ 5.0 mmol/L、蛋白胨15.0 g/L、酵母浸出膏21.5 g/L。预测最优结果为17.4% (v/v),实测均值为17.1% (v/v),相对误差为1.7%。在该优化条件下,终点乙醇浓度比优化前提高了30%,发酵时间缩短了24 h。与单因素条件相比,在该条件下的菌体具有更高的质膜ATP酶活力和更多的胞内海藻糖积累量,表明其促进发酵的机理与单因素相似。
第一章 文献综述 12-23
    1.1 超高浓度 (Very High Gravity, VHG) 乙醇发酵的研究背景 12-13
    1.2 VHG 乙醇发酵的定义 13-14
    1.3 VHG 乙醇发酵的优势及存在问题 14-15
        1.3.1 VHG 乙醇发酵的优势 14
        1.3.2 VHG 乙醇发酵存在的问题 14-15
    1.4 VHG 乙醇发酵的影响因素 15-16
        1.4.1 葡萄糖浓度的影响 15
        1.4.2 乙醇的抑制作用 15-16
        1.4.3 副营养物匮乏的影响 16
        1.4.4 其它因素的影响 16
    1.5 VHG 乙醇发酵国内外研究进展 16-18
        1.5.1 耐高浓度乙醇酵母菌的选育 16-17
        1.5.2 发酵工艺控制的研究 17-18
    1.6 环境压力下酵母菌的适应性响应 18-20
        1.6.1 质膜ATP 酶在酵母菌中的作用 19
        1.6.2 胞内海藻糖与酵母菌抗逆性的关系 19-20
    1.7 VHG 乙醇发酵的研究发展水平及潜在问题 20-21
    1.8 自絮凝酵母SPSC 的特点 21-22
    1.9 论文研究思路的确立和意义 22-23
第二章 起始葡萄糖浓度对自絮凝酵母VHG 乙醇发酵的影响 23-31
    2.1 引言 23
    2.2 材料与方法 23-27
        2.2.1 试剂 23
        2.2.2 仪器 23-24
        2.2.3 菌种 24
        2.2.4 培养基 24-25
        2.2.5 培养方法 25
        2.2.6 发酵液乙醇浓度的测定 25
        2.2.7 发酵液残糖浓度的测定 25-26
        2.2.8 菌体生长的测定 26
        2.2.9 发酵参数的计算 26-27
        2.2.10 实验数据处理方法 27
    2.3 结果与讨论 27-30
        2.3.1 葡萄糖标准曲线的绘制 27
        2.3.2 常规葡萄糖浓度条件下菌体发酵能力的考察 27-28
        2.3.3 不同起始葡萄糖浓度对菌体发酵能力的影响 28-30
    2.4 小结 30-31
第三章 金属离子和氮源对自絮凝酵母VHG 乙醇发酵的影响 31-40
    3.1 引言 31
    3.2 材料与方法 31-32
        3.2.1 试剂 31
        3.2.2 菌种 31
        3.2.3 培养基 31-32
        3.2.4 培养方法 32
        3.2.5 工艺技术指标的分析 32
        3.2.6 实验数据处理方法 32
    3.3 结果与讨论 32-39
        3.3.1 Mg~(2+)对菌体VHG 乙醇发酵的影响 32-34
        3.3.2 Ca~(2+)对菌体VHG 乙醇发酵的影响 34-35
        3.3.3 酵母浸出膏对菌体VHG 乙醇发酵的影响 35-37
        3.3.4 蛋白胨对菌体VHG 乙醇发酵的影响 37-38
        3.3.5 甘氨酸对菌体VHG 乙醇发酵的影响 38-39
    3.4 小结 39-40
第四章 金属离子和氮源对自絮凝酵母VHG 乙醇发酵影响的作用方式 40-53
    4.1 引言 40
    4.2 材料与方法 40-43
        4.2.1 试剂 40-41
        4.2.2 仪器 41
        4.2.3 培养基 41
        4.2.4 培养方法 41-42
        4.2.5 质膜ATP 酶的测定 42
        4.2.6 胞内海藻糖的测定 42-43
        4.2.7 细胞膜透性系数的测定 43
        4.2.8 实验数据处理方法 43
    4.3 结果与讨论 43-52
        4.3.1 标准曲线的绘制 43-45
        4.3.2 不同培养条件对VHG 乙醇发酵和菌体生长的影响 45-46
        4.3.3 氮源浓度对菌体VHG乙醇发酵条件下质膜ATP酶活力和胞内海藻糖含量的影响 46-48
        4.3.4 金属离子对菌体VHG 乙醇发酵条件下质膜 ATP 酶活力和胞内海藻糖含量的影响 48-50
        4.3.5 不同VHG 乙醇发酵条件对菌体细胞膜透性的影响 50-52
    4.4 小结 52-53
第五章 自絮凝酵母VHG 乙醇发酵培养基的优化及其生理生化效应 53-60
    5.1 引言 53
    5.2 材料与方法 53-54
        5.2.1 菌种及培养方法 53
        5.2.2 试验方案设计 53
        5.2.3 工艺技术指标的分析 53-54
        5.2.4 质膜ATP 酶活力的测定 54
        5.2.5 胞内海藻糖浓度的测定 54
        5.2.6 细胞膜透性系数的测定 54
        5.2.7 实验数据处理方法 54
    5.3 结果与讨论 54-59
        5.3.1 均匀设计优化VHG 乙醇发酵培养基组成 54-56
        5.3.2 最佳培养基条件下菌体的VHG 乙醇发酵 56-57
        5.3.3 最佳培养基条件下菌体VHG 乙醇发酵中质膜ATP 酶活力的变化 57-58
        5.3.4 最佳培养基条件下菌体VHG 乙醇发酵中胞内海藻糖含量的变化 58
        5.3.5 最佳培养基条件下菌体VHG 乙醇发酵中细胞膜透性的变化 58-59
    5.4 小结 59-60
第六章 总结与展望 60-63
    6.1 结论 60-61
    6.2 创新点 61
    6.3 工作展望 61-63
        6.3.1 发酵工艺控制与工业应用相结合 62
        6.3.2 深化具体机制的研究 62
        6.3.3 加强胁迫耐受性遗传控制基础的研究 62-63